Bagaimana cara pengukuran aktivitas Antibakteri?

Sains Biologi
1

mikrobiologi

Banyak bahan-bahan alami disekitar kita yang ternyata memiliki sifat antibakteri maupun antimikrobial. Namun bagaimana cara pengukuran aktivitas Antibakterinya?

2

Pengukuran aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode dilusi (pengenceran) atau dengan metode difusi.

  1. Metode Dilusi
    Metode ini menggunakan antimikroba dengan konsentrasi yang berbeda-beda dimasukkan pada media cair. Media tersebut langsung diinokulasikan dengan bakteri dan diinkubasi. Tujuan dari percobaan ini adalah menentukan konsentrasi terkecil suatu zat antibakteri dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri uji. Metode dilusi agar membutuhkan waktu lama dalam pengerjaannya sehingga jarang digunakan (Jawetz, dkk., 2001). Berikut ini gambaran metode dilusi :

    image

  2. Metode Difusi
    Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar dengan menggunakan cakram kertas, cakram kaca, pencetak lubang. Prinsip metode ini adalah mengukur zona hambatan pertumbuhan bakteri yang terjadi akibat difusi zat yang bersifat sebagai antibakteri di dalam media padat melalui pencadang. Daerah hambatan pertumbuhan bakteri adalah daerah jernih di sekitar cakram. Luas daerah hambatan berbanding lurus dengan aktivitas antibakteri, semakin kuat daya aktivitas antibakterinya maka semakin luas daerah hambatnya. Metode ini dipengaruhi oleh banyak faktor fisik dan kimia, misalnya: pH, suhu, zat inhibitor, sifat dari media dan kemampuan difusi, ukuran molekul dan stabilitas dari bahan obat (Jawetz, dkk., 2001). Berikut ini gambaran metode difusi :

    image

1 Like
3

Penentuan aktivitas antibakteri secara in vitro dapat dikelompokkan dalam dua metode, yaitu :

  1. Metode turbidimetri (metode tabung)
    Pada cara turbidimetri, digunakan medium cair dalam tabung reaksi. Pengamatan dengan melihat kekeruhan yang terjadi akibat pertumbuhan bakteri. Kadar antibakteri ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer (Wattimena dkk., 1981). Metode turbidimetri mempunyai beberapa kelebihan antara lain alatnya cukup sederhana, mudah dioperasikan, cepat dan biaya tidak mahal, sedangkan kelemahan metode ini karena sifatnya multi unsur sehingga faktor interferensi dari unsur-unsur lain sangat berpengaruh (Padmaningrum dan Marwati, 2015).

  2. Metode difusi (metode lempeng)
    Pada cara difusi agar digunakan medium agar padat dan resevoir yang dapat berupa cakram kertas, silinder atau sumuran yang dibuat pada medium padat. Larutan uji akan berdifusi dari sumuran ke permukaan medium agar padat yang telah diinokulasi bakteri. Bakteri akan terhambat pertumbuhannya dengan pengamatan berupa lingkaran atau zona di sekeliling sumuran (Wattimena dkk., 1981). Kelebihan metode ini adalah dapat dilakukan pengujian secara lebih banyak dalam satu kali kegiatan dan memerlukan tenaga yang tidak terlalu banyak. Kekurangannya tidak diketahui secara pasti aksi penghambatan yaitu bakterisidal atau bakteriostatik (Harti, 2015).

    Menurut Wattimena dkk. (1981), faktor-faktor yang memengaruhi metode difusi agar, yaitu :

    • Pradifusi, perbedaan waktu pradifusi memengaruhi jarak difusi dari zat uji yaitu difusi antar pencadang.

    • Ketebalan medium agar penting untuk memperoleh sensitivitas yang optimal. Perbedaan ketebalan medium agar memengaruhi difusi dari zat uji ke dalam agar, sehingga akan memengaruhi diameter hambat. Makin tebal medium yang digunakan akan makin kecil diameter hambat yang terjadi.

    • Kerapatan inokulum, ukuran inokulum merupakan faktor terpenting yang memengaruhi lebar daerah hambat, jumlah inokulum yang lebih sedikit menyebabkan obat dapat berdifusi lebih jauh, sehingga daerah yang dihasilkan lebih besar, sedangkan jika jumlah inokulum lebih besar maka akan dihasilkan daerah hambat yang kecil.

    • Komposisi medium agar, perubahan komposisi medium dapat merubah sifat medium sehingga jarak difusi berubah. Medium agar berpengaruh terhadap ukuran daerah hambat dalam hal memengaruhi aktivitas beberapa bakteri, memengaruhi kecepatan difusi antibakteri dan memengaruhi kecepatan pertumbuhan antibakteri.

    • Suhu inkubasi, kebanyakan bakteri tumbuh baik pada suhu 37 oC.

    • Waktu inkubasi disesuaikan dengan pertumbuhan bakteri, karena luas daerah hambat ditentukan beberapa jam pertama, setelah diinokulasikan pada medium agar, maka daerah hambat dapat diamati segera setelah adanya pertumbuhan bakteri.

    • Pengaruh pH, adanya perbedaan pH medium yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan jumlah zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan jumlah molekul zat uji yang mengion. Selain itu pH berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri.

Kriteria kekuatan daya antibakteri sebagai berikut :

  • Diameter zona hambat 5 mm atau kurang dikategorikan lemah,
  • Diameter zona hambat 5-10 mm dikategorikan sedang, zona hambat 10-20 mm dikategorikan kuat
  • Diameter zona hambat 20 mm atau lebih dikategorikan sangat kuat (Davis dan Stout, 1971).

Klindamisin merupakan contoh dari linkosamid. Seperti eritormisin, obat ini juga menghambat sintesis protein bakteri dan mempunyai efek kerja bakteriostatik dan bakterisidal, tergantung dari dosis obatnya. Klindamisin aktif melawan kebanyakan dari organisme gram positif, termasuk Staphylococcus aureus dan organisme anaerobik. Obat ini tidak efektif melawan bakteri gram negatif, seperti Escherichia coli, Proteus, dan Pseudomonas (Kee dan Hayes, 1996).

Klindamisin diabsorpsi lebih baik daripada linkomisin melalui saluran gastrointestinal dan kadar obat dalam serum dipertahankan lebih tinggi. Klindamisin dianggap lebih efektif daripada linkomisin dan mempunyai lebih sedikit efek toksik (Kee dan Hayes, 1996). Klindamisin sudah banyak menggantikan senyawa induknya. Banyak digunakan topikal pada acne berkat efek menghambatnya terhadap Propionibacterium acnes. Resistensi belum dilaporkan. Efek sampingnya sama dengan linkomisin, pada penggunaan topikal dapat menyebabkan kulit kering atau berlemak, iritasi, eritema dan rasa terbakar pada mata (Tjay dan Rahardja, 2007).

4

Terdapat beberapa metode pengukuran aktivitas antibakteri, yaitu :

  1. Metode Difusi
    Pada metode ini, penentuan aktivitas didasarkan pada kemampuan difusi dari zat antimikroba dalam lempeng agar yang telah diinokulasikan dengan mikroba uji. Hasil pengamatan yang akan diperoleh berupa ada atau tidaknya zona hambatan yang akan terbentuk disekeliling zat antimikroba pada waktu tertentu masa inkubasi (Brooks, 2007). Metode ini dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu :

    • Cara Cakram ( Disc )
      Cara ini merupakan cara yang paling sering digunakan untuk menentukan kepekaan kuman terhadap berbagai macam obat-obatan. Pada cara ini digunakan suatu cakram kertas saring ( Paper Disc ) yang berfungsi sebagai tempat menampung zat antimikroba. Kertas saring tersebut kemudian diletakkan pada lempeng agar yang telah diinokulasi mikroba uji, kemudian diinkubasi pada waktu dan suhu tertentu, sesuai dengan kondisi optimum dari mikroba uji. Pada umumnya, hasil yang di dapat bisa diamati setelah inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC. Hasil pengamatan yang diperoleh berupa ada atau tidaknya daerah bening yang terbentuk disekeliling kertas cakram yang menunjukkan zona hambat pada pertumbuhan bakteri (Pelczar, 1998).

    • Cara Parit ( Ditch )
      Suatu lempeng agar yang telah diinokulasikan dengan bakteri uji dibuat sebidang parit. Parit tersebut berisi zat antimikroba, kemudian diinkubasi pada waktu dan suhu optimum yang sesuai untuk mikroba uji. Hasil pengamatan yang akan diperoleh berupa ada tidaknya zona hambat yang akan terbentuk di sekitar parit (Bonang, 1992).

    • Cara Sumuran ( Hole / Cup )
      Pada lempeng agar yang telah diinokulasikan dengan bakteri uji dibuat suatu lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak lubang disesuaikan dengan tujuan penelitian. Kemudian setiap lubang diisi dengan zat uji. Setelah diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai dengan mikroba uji, dilakukan pengamatan dengan melihat ada atau tidaknya zona hambatan di sekeliling lubang (Bonang, 1992; Kusmayati & Agustini, 2007). Metode ini umum digunakan dalam uji efek antibakteri karena lebih efektif untuk menghambat pertumbuhan bakteri dan zat aktif dapat berdifusi langsung tanpa penghalang kertas cakram (seperti pada metode Kirby Bauer yang menggunakan kertas cakram) (Rahman et al ., 2012).

      Diameter zona hambat merupakan petunjuk kepekaan bakteri penguji, dengan semakin besarnya zona hambat maka antibakteri tersebut mempunyai aktivitas antibakteri yang semakin baik (Panagan & Syarif, 2009).

  2. Metode Dilusi
    Pada metode ini dilakukan dengan mencampurkan zat antimikroba dan media agar, kemudian diinokulasikan dengan mikroba uji. Hasil pengamatan yang akan diperoleh berupa tumbuh atau tidaknya mikroba di dalam media. Aktivitas zat antimikroba ditentukan dengan melihat konsentrasi hambat minimum (KHM) yang merupakan konsentrasi terkecil dari zat antimikroba uji yang masih memberikan efek penghambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji (Pratiwi, 2008). Metode ini terdiri atas dua cara yaitu :

    • Pengenceran Serial dalam Tabung
      Pengujian dilakukan dengan menggunakan sederetan tabung reaksi yang diisi dengan inokulum kuman dan larutan antibakteri dalam berbagai konsentrasi. Zat yang akan diuji aktivitas bakterinya diencerkan sesuai serial dalam media cair, kemudian diinokulasikan dengan kuman dan diinkubasi pada waktu dan suhu yang sesuai dengan mikroba uji. Aktivitas zat ditentukan sebagai kadar hambat minimal (KHM) (Pratiwi, 2008).

    • Penipisan Lempeng Agar
      Zat antibakteri diencerkan dalam media agar dan kemudian dituangkan kedalam cawan petri. Setelah agar membeku, diinokulasikan kuman kemudian diinkubasi pada waktu dan suhu tertentu. Konsentrasi terendah dari larutan zat antibakteri yang masih memberikan hambatan terhadap pertumbuhan kuman ditetapkan sebagai konsentrasi hambat minimal (KHM) (Pratiwi, 2008).

      Metode yang sering digunakan dalam laboratorium untuk menentukan efek antimikroba yaitu cakram kertas, metode cairan dalam cincin, dan metode sumur agar, sedangkan metode pengenceran dalam cairan merupakan metode sederhana dan efektif untuk menentukan harga konsentrasi daya hambat minimal dari suatu antibiotik terhadap bakteri tertentu. MIC adalah konsentrasi hambat terkecil dari larutan sampel yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme secara in vitro (Volk & Wheeler, 2003).