DNA ( Deoxyribonucleic acid ) adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada keturunannya. Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa nukelotida.
Identifikasi DNA adalah upaya untuk membandingkan antara profil DNA barang bukti dengan pembanding sehingga dapat disimpulkan apakah profil DNA barang bukti cocok (match) dengan pembanding atau tidak. Pola pewarisan spesifik pada DNA inti dan DNA mitokondria menentukan teknis identifikasi DNA. Identifikasi DNA inti dapat dilakukan dari semua sel tubuh yang memiliki inti.
Sampel yang didapatkan dari TKP harus diperlakukan sebagai barang bukti. Oleh karena itu, pengumpulan sampel harus dilakukan dengan hati-hati, disimpan dan diawetkan agar hasil pemeriksaan dapat digunakan dalam pengadilan. Pengumpulan sampel yang buruk dapat menyebabkan DNA terdegradasi atau fragmen DNA yang terlalu pendek sehingga sulit untuk dianalisis. Aspek penting lain adalah menjaga agar sampel tidak terkontaminasi. Beberapa spesimen biologis yang sering didapatkan pada TKP dan dijadikan material pemeriksaan DNA diantaranya adalah darah, tulang, ketombe, rambut, feses, kuku, sidik jari, sekret hidung dan telinga, saliva, keringat, urin, semen, dan cairan vagina.
Tiap jenis spesimen biologis memiliki standar prosedur pengambilan dan pengawetan sampel tersendiri.
Identifikasi DNA sampel terdiri atas lima langkah:
Pemeriksaan pendahuluan terhadap sampel
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA yang telah diekstrak menggunakan PCR
Pemisahan dan visualisasi profil DNA
Membandingkan dan interpretasi profil DNA
Terdapat beberapa prinsip umum dalam melakukan pengambilan dan pengumpulan spesimen biologis dari barang bukti, di antaranya:
Semua barang bukti yang diperkirakan mengandung jaringan, atau pernah mengalami kontak langsung dengan bagian tubuh orang yang hendak diidentifikasi harus dikumpulkan dan diambil menggunakan alat steril (pinset plastik sterile disposable atau tangan bersarung tangan).
Setiap barang bukti hendaknya dikemas tersendiri menggunakan amplop baru dan diberi label untuk kemudian dikirim ke laboratorium.
Sarung tangan yang digunakan hendaknya steril, sekali pakai dan tidak mengandung bedak.
Petugas menggunakan penutup rambut dan masker untuk mencegah kontaminasi.
Hindari kesalahan pelabelan spesimen.
Untuk sampel rambut, pengumpulan sampel yang didapatkan dari metode yang berbeda, yaitu dicabut dan disisir, sebaiknya menggunakan tempat yang terpisah.
Sebelum dibawa ke laboratorium, spesimen sebaiknya disimpan dalam keadaan kering dan dingin. Kondisi ini mengurangi kecepatan pertumbuhan bakteri dan degradasi DNA. Dalam laboratorium, sampel DNA disimpan dalam kulkas dengan suhu 4ºC atau di freezer pada suhu -20ºC.
Pemeriksaan pendahuluan atau skrining merupakan pemeriksaan yang dilakukan untuk memeriksa dan memastikan sebuah sampel yang didapatkan dari TKP. Setiap jaringan memiliki karakteristik yang spesifik namun tidak unik. Contohnya, semen memiliki konsentrasi asam fosfatase yang tinggi, tapi enzim ini juga ditemukan pada sekresi tubuh lainnya, termasuk sekresi vagina.
Pemeriksaan pendahuluan bermacam-macam jenisnya tergantung spesimen yang akan diperiksa. Beberapa contoh pemeriksaan pendahuluan adalah tes benzinin dan tes o-tolodin untuk spesimen yang dicurigai darah, pemeriksaan mikroskopis, pengecatan, dan tes alkali phosphatase untuk spesimen yang dicurigai semen.
Pemeriksaan pendahuluan terhadap sampel rambut yang biasa dikerjakan berupa pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, dan kimiawi. Pemeriksaan makroskopik mencakup panjang, warna, dan karakteristik gelombang pada rambut. Pemeriksaan mikroskopis mencakup pola dari medula rambut, pigmentasi korteks, dan tipe sisik kutikula. Pemeriksaan kimiawi digunakan untuk melihat bahan kimiawi yang diserap oleh kulit atau dicerna tubuh seperti obat-obatan, toksin arsen, dan timbal.
Molekul DNA harus dipisahkan dari material seluler lainnya sebelum dapat diperiksa. Protein sel yang menyelubungi dan melindungi DNA dapat menghambat kemampuan menganalisis DNA. Oleh karena itu, metode untuk mengekstrasi DNA telah dikembangkan untuk memisahkan protein dan materi seluler lainnya dari molekul DNA. Selain itu, kuantitas dan kualitas DNA sering diukur sebelum proses lanjutan lainnya untuk memastikan akan didapatkan hasil yang optimal.
Ekstraksi DNA secara umum memiliki tahapan-tahapan yang meliputi isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi serta presipitasi atau pemadatan.
Gambar Langkah-langkah Ekstraksi DNA
Dalam prosesnya, terdapat tiga larutan penting dalam isolasi DNA, yaitu larutan buffer untuk lisis, larutan buffer untuk digesti, dan protein kinase K. Proses penghancuran sel (lisis) secara kimia dilakukan dengan mamanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (Etil Ediamin Tetra Asetat) dan SDS (Sodium Dodesil Sulfat). EDTA merusak atau menghancurkan sel dengan cara mengikat ion magnesium. Ion magnesium berfungsi dalam mempertahankan integritas sel dan mengingkatkan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. SDS yang merupakan sejenis deterjen digunakan untuk merusak membran sel.
Kotoran (debris sel) yang ditimbulkan akibat proses penghancuran sel dapat dibersihkakn dengan cara sentrifuge sehingga yang tertinggal di dasar tabung hanya molekul nukelotida (DNA, RNA, serta protein). Protein dapat dihilangkan dengan bantuan enzim proteinase, sedangkan RNA juga dibersihkan dari larutan dengan RNAse sehingga DNA dapat diisolasi seutuhnya.
Gambar Metode dan Proses Ekstraksi DNA
Terdapat tiga teknik primer yang digunakan dalam laboratorium forensik DNA untuk ekstraksi DNA, yaitu ekstraksi organik (fenol-kloroform), ekstraksi Chelex, dan kertas FTA.
Ekstraksi Organik
Ekstraksi organik, juga disebut ekstraksi fenol-kloroform, telah digunakan paling lama dan dapat digunakan untuk situasi di mana RFLP dan atau PCR digunakan. DNA dengan berat molekul tinggi yang penting untuk metode RFLP dapat diperoleh paling efektif melalui cara ini namun metode ini memakan waktu lama, melibatkan bahan kimia berbahaya dan memerlukan pemindahan bahan melalui beberapa tabung sehingga menaikkan risiko kontaminasi.
Metode Chelex
Metode ini dapat mengekstraksi DNA lebih cepat dari metode organik. Selain itu, ekstraksi Chelex melibatkan lebih sedikit langkah sehingga kontaminasi bisa diminimalisisasi. Namun, metode ini menghasilkan DNA untai tunggal sehingga hanya berguna untuk prosedur berbasis PCR. Selain itu, tes ini juga menghilangkan inhibitor PCR sehingga dapat menjadi suatu keuntungan untuk PCR.
FTA paper
FTA paper adalah kertas serap berbasis selulosa. Metode ini memiliki keuntungan karena menghasilkan data konsisten dan dapat diautomatisasi.
Ekstrasi fase-solid
Merupakan ekstraksi di mana DNA diikat secara selektif pada sebuah substrat seperti silica dan dilepaskan pada pencucian yang memisahkan DNA dari protein dan komponen seluler lainnya. Metode yang paling banyak digunakan adalah Qiagen columns, DNA IQ, dan PrepFiler.
Differential extraction
Modifikasi ekstraksi organik yang memisahkan sel epitel dan sel sperma. Metode ini umum digunakan untuk mengisolasi DNA pria dan wanita pada barang bukti kasus-kasus perkosaan yang mengandung campuran kedua jenis DNA tersebut.
Tabel Jumlah DNA yang Umumnya Diekstraksi dari Spesimen Biologis4
| Tipe Sampel | Jumlah DNA |
|---|---|
| Darah cair | 20.000 – 40.000 ng/ml |
| Noda darah | 250 – 500 ng/cm2 |
| Air mani | 150.000 – 300.000 ng/ml |
| Swab vagina postcoital | 10 – 3000 ng/swab |
| Rambut dicabut (dengan akar) | 1 – 750 ng/akar |
| Rambut rontok (dengan akar) | 1 – 10 ng/akar |
| Air liur | 1000 – 10.000 ng/ml |
| Swab bukal | 100 – 1500 ng/swab |
| Urin | 1 – 20 ng/ml |
| Tulang | 3 – 10 ng/mg |
| Jaringan | 50 – 500 ng/mg |
Kuantikasi DNA merupakan suatu proses untuk memastikan bahwa DNA yang didapatkan dari ekstraksi adalah benar berasal dari manusia dan bukan berasal dari misalnya bakteri. Selain itu, kuantifikasi DNA dalam sampel juga penting dalam pemeriksaan PCR. Dalam pemeriksaan DNA tidak diharapkan jumlah DNA yang terlalu kecil atau jumlah DNA yang terlalu banyak. DNA yang terlalu banyak dapat menyebabkan kesulitan saat interpretasi dan memakan waktu yang lebih lama, sedangkan DNA yang terlalu sedikit dapat mengakibatkan hilangnya alel-alel yang diperlukan karena reaksi PCR gagal untuk mengamplifikasi DNA dengan baik. Jumlah DNA yang dikehendaki untuk pemeriksaan DNA adalah antara 0.5 ng – 2.0 ng.4,21
Metode yang digunakan untuk kuantifikasi DNA biasanya berupa absrobansi pada panjang gelombang 260 nm atau menggunakan fluorescence setelah pewarnaan menggunakan ethidium bromide. Namun, kekurangan dan metode ini adalah tidak begitu sensitif dan pengukuran absorbansi tidak spesifik untuk DNA sehingga protein kontaminan atau fenol sisa ekstraksi dapat memberi perhitungan yang salah. Sekarang, telah dikembangkan beberapa metode baru seperti prosedur slot blot dan microtiter plate assay berbasis fluoresensi yang dapat disebut “real-time atau kuantitatif PCR”.
Gambar Kuantifikasi DNA dalam PCR