Gel elektroforesis protein adalah teknik pemisahan molekul protein berdasarkan sifat fisikanya seperti muatan atau massanya dalam matriks gel menggunakan arus listrik. Protein umumnya dipisahkan dengan cara ini menggunakan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) untuk mengidentifikasi individual protein di dalam sampel kompleks atau untuk menguji protein multi unit dalam suatu sampel protein.
Ada beberapa bentuk PAGE yang menyediakan tipe yang berbeda dari informasi tentang protein. PAGE nondenaturasi yang dinamakan juga NATIVE-PAGE. PAGE ini memisahkan protein menurut ratio massa-muatannya. PAGE denaturasi dan reduksi yang dinamakan juga SDS-PAGE. Teknik elektroforesis ini paling luas digunakan untuk memisahkan protein terutama berdasarkan massanya.
SDS-PAGE memisahkan protein terutama berdasarkan massanya karena detergent ionik sodium dodecyl sulfate (SDS) mendenaturasi dan mengikat protein untuk membuat protein bermuatan negatif. Dengan demikian, ketika arus listrik dialirkan pada gel semua protein yang berikatan dengan SDS di dalam sampel akan bermigrasi melalui gel menuju anoda (elektroda muatan positif). Protein dengan massa rendah bergerak lebih cepat melalui gel dibandingkan protein dengan massa yang lebih besar karena efek pengayakan ‘sieving effect’ dari matriks gel.
Acrylamide adalah material untuk membuat gel elektroforesis. Reaksi antara acrylamide dengan bisacrylamide membentuk suatu jaringan polimer saling silang ketika zat dipolimerasi, ammonium persulfate (APS) ditambahkan. TEMED (N,N,N,N’ tetramethylenediamine) mengkatalisis reaksi polimerisasi dengan memproduksi radikal bebas oleh APS.
Perbandingan bisacrylamide (BIS) dengan acrylamide mempengaruhi ukuran pori dan kekakuan matriks gel. Komposisi gel SDS-PAGE dimuat pada tabel berikut
Gels dengan persentasi rendah acrylamide khususnya digunakan untuk memisahkan protein-protein besar, sedangkan gel dengan presentasi acrylamide tinggi digunakan untuk memisahkan protein-protein kecil. Pada “Gradient gels” disediakan persenacrylamide persen rendah pada bagian atas (permulaan dari jalur sampel) dan *persen-*acrylamide tinggi pada bagian bawah, yang memungkinkan rentang ukuran protein yang lebih lebar dapat dipisahkan.
Gel elektrophoresis direndam di dalam bufer untuk menyediakan kondisi agar arus listrik melewati matriks gel. Bufer ini dituang di dalam ruang tipis antara dua plate gelas atau plate plastik dari perangkat alat yang dinamakan “cassette”. Setelah gel terpolimerisasi kaset diletakkan vertikal pada ujung atas bawah kotak bejana bufer yang mengandung elektroda katoda dan anoda. Sampel protein dimasukkan ke dalam sumur tepi atas. Ketika arus listrik dialirkan mengakibatkan protein pada sumur ditarik oleh arus listrik melalui matrik gel.
Untuk memperoleh resolusi protein yang optimal, sebuah ‘stacking gel’ diletakan pada bagian atas dari ‘resolving gel’. ‘Stacking gel’ mempunyai konsentrasi acrylamide yang rendah (yaitu 7% untuk pori yang lebih besar), pH rendah (yaitu 6.8) dan kandungan ionik yang berbeda. Hal ini memungkinkan protein dalam sampel yang diloadingkan untuk dipekatkan dalam sebuah pita ketat selama beberapa menit pertama dari elektroforesis sebelum bagian dari ‘resolving gel’. ‘Stacking gel’ tidak diperlukan jika menggunakan gradient gel karena gradien gel telah menunjukkan fungsi ini.
Sampel dimasukkan ke sumur pada bagian atas gel. Jika arus listrik dialirkan maka protein bergerak melalui matriks gel dan protein terpisah yang kita namakan “pita” protein. Sampel yang diload berdekatan dengan ‘protein marker’ dan dielektroforesis bersama-sama dapat saling dibandingkan setelah langkah pewarnaan (staining). Intensitas dari pewarnaan and ketebalan pita protein mengidentifikasikan kelimpahan relatifnya. Posisi pita protein pada gel elektroforesis dapat menunjukkan ukuran relatifnya.
NATIVE-PAGE
Pada NATIVE-PAGE, protein dipisahkan menurut muatan total, ukuran dan bentuk dari struktur nativenya. Pergerakan protein terjadi karena kebanyakan protein membawa muatan negatif total di dalam running buffer alkali. Densitas muatan negatif yang lebih besar (muatan permolekul yang lebih besar) dari protein akan bermigrasi lebih cepat. Pada saat yang sama, gaya gesekan dari matriks gel menciptakan efek penyaringan, memperlambat gerakan protein sesuai dengan ukuran dan bentuk tiga dimensinya. Protein kecil menghadapi hanya gaya gesekan kecil sementara protein besar menghadapi gaya gesekan yang lebih besar. Dengan demikian, NATIVE-PAGE memisahkan protein berdasarkan muatan dan massa proteinnya.
Pada NATIVE-PAGE tidak dilakukan denaturasi, akibatnya interaksi subunit dalam protein multisubunit pada umumnya terpelihara dan dapat diperoleh informasi tentang struktur quartener protein tersebut. Sebagai tambahan, beberapa protein tetap terpelihara aktivitas enzimatiknya jika pemisahan protein dilakukan dengan NATIVE-PAGE. Dengan demikian, NATIVE-PAGE digunakan untuk penyediaan protein murni dan aktif. Setelah elektroforesis, protein dapat diambil kembali dari gel NATIVE-PAGE dengan difusi pasif atau elektro elusi. Agar integritas protein selama elektroforesis dapat dipertahankan, adalah sangat penting untuk menjaga peralatan tetap dingin dan meminimalkan efek denaturasi dan proteolisis. Pada NATIVE-PAGE, pH ekstrim umumnya harus dihindari karena dapat menyebabkan kerusakan irreversibel protein yang sedang diteliti, seperti denaturasi atau agregasi.
SDS-PAGE
Pada SDS-PAGE gel direndam dalam bufer mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) dan sampel protein dipanaskan dengan SDS sebelum dielektroforesis sehingga density muatan dari semua protein dibuat kira-kira sama. Pemanasan dalam SDS, suatu detergent anionik akan mendenaturasi protein dalam sampel dan mengikat erat molekul uncoiled. Biasanya, zat pereduksi seperti dithiothreitol (DTT) juga ditambahkan untuk memutus ikatan disulfida protein dan memastikan bahwa tidak ada struktur quartener protein. Sebagai akibatnya, ketika sampel ini dielektroforesis, protein memisah sesuai dengan massa saja, dengan sangat sedikit efek dari perbedaan komposisi.
Ketika satu set protein dengan berat molekul yang diketahui di”run” disamping sampel dalam gel yang sama, maka pita-pita protein memberikan referensi dimana massa protein sampel dapat ditentukan. Satu set protein referensi disebut sebagai penanda berat molekul atau standar, dan protein tersebut tersedia secara komersial dalam beberapa bentuk. SDS-PAGE juga digunakan untuk pemisahan rutin dan analisis protein karena kemampuan kecepatan, kesederhanaan.
Untuk memperkirakan berat molekul protein sampel (unknown protein) dengan SDS-PAGE dapat dilakukan dengan cara mengukur jarak migrasi protein standar dan migrasi protein sampel. Data migrasi protein dijadikan sumbu X dan log Mr protein standar sebagai sumbu Y. Dengan demikian, jika jarak migrasi protein sampel diketahui, maka dapat ditentukan perkiraan Mr molekul protein tersebut.
Penyediaan protein sampel untuk analisis dengan SDS-PAGE adalah protein sampel ditambah dengan buffer sampel yang mengandung 1% SDS dengan atau tanpa zat pereduksi seperti 20mM DTT, 2-mercaptoethanol (BME) atau TCEP, kemudian didenaturasi dengan pemanasan dengan cara direbus selama 3 sampai 5 menit di dalam air mendidih. Sampel kemudian didinginkan sampai suhu kamar sebelum dipipet ke sumur sampel pada gel. Loading bufer juga mengandung gliserol sehingga protein lebih berat dari pada air dan tenggelam dengan baik ke bagian bawah sumur ketika sampel dimasukan ke sumur gel SDS-PAGE. Pewarna untuk loading bufer sampel adalah biru bromophenol yang memungkinkan seseorang memantau proses elektroforesis.
Jika pita protein telah dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid, protein tersebut dapat ditransfer ke membran untuk analisis melalui Western blotting atau divisualisasikan langsung dalam gel menggunakan berbagai pewarnaan atau metoda deteksi. Coomassie dye adalah reagen yang paling popular untuk menstaning pita protein gel elektroforesis. Pada kondisi bufer asam, Coomassie dye berikatan dengan residu hidrofobik dari protein merubah pita protein menjadi biru. Seperti semua metode pewarnaan, Coomassie dye mendeteksi beberapa protein yang lebih baik daripada yang lain berdasarkan aksi kimia protein dan perbedaan komposisi protein. Pada kebanyakan protein, reagen Coomassie dye mendeteksi paling sedikit 10 nanogram per pita dalam sebuah gel mini.