Bagaimana penentuan spesies pada bakteri?

Ukuran bakteri (prokariot) kecil dibandingkan eukariot dan mempunyai keragaman morfologis yang rendah. Bagaimana metoda pengklasifikasian bakteri dengan tepat ? Oleh sebab itu, metoda fenotifik yang dilengkapi dengan metoda genotipik sebaiknya digunakan untuk mengklasifikasikan bakteri. Pendekatan dengan metoda fenotifik meliputi ekspresi sifat diantaranya warna koloni, bentuk koloni, pewarnaan gram dan uji biokimia.

Pengklasifikasian mikroba menggunakan pendekatan genomik dapat ditujukan pada DNA total atau urutan basa nukleotida suatu gen. Analisis DNA total seperti AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), sedangkan gen individual seperti gen 16S rRNA untuk prokariot dan gen 18S rRNA untuk eukariot. Gen 16S rRNA paling banyak digunakan sebagai penanda molekuler untuk penentuan spesies bakteri pada saat ini. Kemiripan urutan basa nukleotida gen 16S rRNA digunakan sebagai “gold standard” untuk mengidentifikasi bakteri sampai pada tingkat spesies.

Molekul 16S rRNA merupakan salah satu molekul rRNA penyusun ribosom sub unit kecil prokariot. Molekul ini ditranskripsi dari DNA genomik dan membentuk struktur tiga dimensi (lihat gambar A). Molekul 16S rRNA kemudian berikatan dengan 21 protein ribosomal membentuk subunit kecil ribosomal 30S (gambar B dan C) yang berperan pada proses translasi. Subunit kecil ribosomal 30S bergabung dengan subunit besar ribosomal 50S untuk melakukan proses translasi.

Molekul 16S rRNA mempunyai fungsi yang identik pada seluruh organisme, terdistribusi secara universal dan bersifat sangat lestari. Molekul rRNA lainnya pada prokariot adalah 5S rRNA, dan 23S rRNA. Ukuran gen 5S rRNA adalah sekitar 120 basa, 23S rRNA sekitar 2900 basa, 16S rRNA sekitar 1500 basa. Ukuran gen 16S rRNA cukup memadai dan memudahkan dalam proses amplifikasi gen tersebut secara PCR dan dalam proses sekuensing.

Gen 16S rRNA memiliki daerah-daerah yang secara universal bersifat lestari. Pada beberapa bagian lain terdapat daerah yang bersifat semi-lestari dan variabel. Pada gen 16S rRNA terdapat 9 daerah variabel yang ditandai dengan V1 sampai V9. Daerah-daerah variabel tersebut memungkinkan untuk membedakan organisme dalam genus, bahkan spesies tetapi tidak antar strain dalam spesies yang sama. Pada daerah yang sangat lestari (absolutely conserved) dapat dijadikan primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan metoda PCR. Gambar di bawah ini memuat daerah tersebut pada 16S rRNA E. Coli.

Analisis kesamaan urutan basa nukleotida gen 16S rRNA praktis untuk definisi spesies. Derajat kesamaan urutan basa nukleotida gen 16S rRNA > 97% sering dipertimbangkan sebagai kelompok spesies yang sama. Penentuan derajat kesamaan urutan basa nukleotida suatu gen 16S rRNA dengan urutan basa nukleotida gen 16S rRNA lainnya pada GenBank digunakan program BLASTn pada http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Analisis perbandingan urutan basa nukleotida dari gen-gen 16S rRNA digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik dan dapat dijadikan sebagai pengklasifikasian makhluk hidup. Dengan demikian, penggunaan analisis gen 16S rRNA sebagai pendekatan untuk definisi spesies secara molekuler pada bakteri dan dapat menunjukkan hubungan kekerabatan.

Amplifikasi gen 16S rRNA bakteri dengan metoda PCR dapat digunakan primer universal dan primer spesifik untuk spesies bakteri tertentu. Primer universal gen 16S rRNA bakteri adalah primer yang komplemen dengan suatu urutan nukleotida yang umum banyak terdapat dalam gen 16S rRNA dari bermacam-macam sumber bakteri yang berbeda. Daerah ini merupakan daerah yang paling lestari pada gen 16S rRNA bakteri. Primer universal yang dipakai untuk amplifikasi gen 16S rRNA bakteri diantaranya adalah primer 27F (GAGAGTTTGATCCTGGTCCAG), 765R (CTGTTTGCTCCCCACGCTTC) dan 1495R (CTACGGCTACCTTG TTACGA)

Primer gen 16S rRNA dapat spesifik untuk genus bakteri tertentu atau untuk spesies bakteri tertentu. Primer untuk genus Bacillus dirancang berdasarkan penjajaran urutan gen 16S rRNA Bacillus. Primer tersebut adalah 400F (GGAGCGACGCCGCGTG AGCG), 700F (GCAACTGACGCTGAGGCG), 1000F (GCAACGCG AAGAACCTTA). Primer untuk spesies tertentu misalnya primer untuk amplifikasi gen 16S rRNA guna mendeteksi Paenibacillus macerans adalah MAC 1 (ATCAAGTCTTCCG CATGGGA), MAC 2 (ACTCTAGAGTGCCCAMCWTT), sedangkan untuk Bacillus subtilis adalah Bsub5F (AAGTCGAGCGGACAGATGG), Bsub3R (CCAGT TTCCAATGACCCTCCCC).

Langkah yang digunakan untuk mengidentifikasi suatu isolat murni bakteri secara molekular melalui gen 16S rRNA adalah :

  1. mengisolasi DNA genom bakteri

  2. DNA genom tersebut dijadikan template untuk mengisolasi gen 16S rRNA dengan teknik PCR menggunakan primer universal kemudian produk PCR dimurnikan dan dilakukan sekuensing

  3. basa nukleotida hasil sekuensing dibandingkan dengan basa nukleotida sekuens gen 16S rRNA bakteri lain yang terdapat pada basis data GenBank dengan cara menjajarkan. Proses penjajaran basa nukleotida tersebut dapat digunakan program BLASTn yang terdapat pada GenBank. Derajat kesamaan urutan basa nukleotida gen 16S rRNA > 97% sering dipertimbangkan sebagai kelompok spesies yang sama

  4. dan hasil penjajaran dapat dibuat pohon phylogenetic. Pohon phylogenetik dapat dibuat menggunakan program MEGA5.

Seperti pada gambar di atas penjajaran sekuens DNA yang mengkode 16S rRNA dapat ditafsirkan bahwa organisme 1 dan 2 terdapat tiga perbedaan basa, sedangkan organisme 1 dan 3 mempunyai 2 perbedaan basa. Organisme 2 dan 3 terdapat empat perbedaan basa. Dengan demikian, organisme 1 dan 3 relatif paling dekat dibandingkan organisme 2 dan 3 atau 1 dan 2.