Bagaimana cara mengetahui aktivitas antimikroba secara in vitro?

difusionmethod

Antimikroba yang efektif secara klinis adalah yang menunjukkan toksisitas selektif. Maksud dari toksisitas selektif adalah antimikroba berbahaya bagi parasit namun tidak berbahaya bagi inangnya. Bagaimana cara mengetahui aktifitas antimikroba secara in vitro?

1 Like

Uji Aktivitas Antimikroba in vitro


Aktivitas antimikroba diukur secara in vitro untuk menentukan potensi agen antibakteri terlarut, konsentrasinya pada cairan dan jaringan tubuh, dan mengetahui kerentanan mikroorganisme tertentu terhadap konsentrasi antimikroba tertentu. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba in vitro antara lain:

  • pH lingkungan
  • Beberapa obat lebih aktif pada suasana asam dan sebaliknya
  • Komponen dari medium yang digunakan :
    • Media kultur darah menghambat aminoglikosida
    • PABA pada ekstrak jaringan merupakan antagonis sulfonamid
    • Penambahan NaCl pada medium dapat meningkatkan deteksi Staphylococcus aureus yang resisten metisilin.
  • Stabilitas obat
  • Ukuran inokulum
    Semakin besar ukuran inokulum kepekaan mikroorganisme terhadap antibiotik semakin berkurang. Selain itu mutan resisten lebih cenderung muncul pada populasi yang lebih besar.
  • Lama inkubasi
    Semakin lama masa inkubasi pada uji aktivitas antimikroba in vitro, semakin tinggi kemungkinan munculnya mikroorganisme yang resisten.
  • Aktivitas metabolisme mikroorganisme
    Organisme yang aktif dan tumbuh lebih rentan dibandingkan dengan yang sedang dalam fase istirahat.

Untuk menentukan sensitivitas mikroorganisme patogen terhadap obat antimikroba dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode dilusi dan difusi. Penggunaan kedua metode tersebut harus mengikuti metode yang sudah standard. Salah satu metode standard yang dapat digunakan adalah metode Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

  1. Metode dilusi
    Metode ini menggunakan antimikroba dengan konsentrasi yang diencerkan secara serial, baik dengan media cair atau padat. Kemudian bakteri uji diinokulasi pada media dan diinkubasi. Melalui pemeriksaan cara dilusi ini dapat diperoleh konsentrasi hambat minium atau minimum inhibitory concentration (MIC) yaitu konsentrasi terkecil yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Batas akhir yang diambil adalah kadar dimana antimikroba terlarut menghambat atau membunuh bakteri dengan kadar terendah. Uji sensitivitas cara dilusi agar memerlukan waktu pengerjaan yang lama dan penggunaanya dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji sensitivitas dilusi menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai, namun kini ada cara yang lebih sederhana dan banyak digunakan yaitu microdilution plate.

  2. Metode difusi
    Metode difusi agar paling sering digunakan untuk mengetahui kepekaan suatu bakteri terhadap antibiotik. Cakram kertas saring yang berisi sejumlah tertentu obat ditempatkan pada permukaan medium padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji pada permukaannya. Setelah inkubasi, diameter zona hambat sekitar cakram diukur dan dijadikan ukuran kekuatan hambatan obat terhadap organisme uji. Metode ini dipengaruhi beberapa faktor fisik dan kimia, selain faktor antara obat dan organisme (misalnya sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran molekular dan stabilitas obat). Meskipun demikian standardisasi faktor- faktor tersebut memungkinkan untuk dilakukannya uji sensitivitas dengan baik.

Kloramfenikol


Kloramfenikol secara alami dihasilkan dari kultur Streptomyces venezuelae tapi sekarang dapat dibuat secara sintetik. Kloramfenikol berbentuk kristal merupakan senyawa stabil yang diabsorpsi secara cepat dari saluran gastointesitinal, didistribusikan secara luas ke dalam jaringan dan cairan tubuh, termasuk mudah masuk ke sistem saraf pusat dan cairan serebrospinal. Sebagian besar obat diinaktifkan ke dalam hati melalui konjugasi dengan asam glukoronat atau melalui reduksi menjadi arilamin yang inaktif. Ekskresi terutama dalam urin, 90% merupakan bentuk inaktif. Meskipun kloramfenikol biasanya diberikan secara oral, bentuk suksinat dapat diberikan secara intravena dengan dosis yang sama.

Kloramfenikol bekerja dengan menghambat sintesis protein mikroorganisme. Kloramfenikol memiliki spektrum, dosis, kadar dalam darah yang sama dengan tetrasiklin. Obat ini digunakan untuk mengobati beberapa tipe infeksi, biasanya yang disebabkan oleh salmonella, meningokokus, dan H. influenzae .

Kloramfenikol jarang menyebabkan gangguan gastrointestinal. Namun, pemberian lebih dari 3 gram/hari secara teratur dapat menyebabkan gangguan pada maturasi sel darah merah, peningkatan serum besi, dan anemia. Kelainan ini dapat sembuh kembali jika obat dihentikan. Kadang-kadang terjadi idiosinkrasi terhadap kloramfenikol dan mengakibatkan anemia aplastik fatal yang serius. Karena alasan ini, penggunaan kloramfenikol umumnya dibatasi pada infeksi yang jelas berdasarkan pengalaman dan uji laboratorium.
Kloramfenikol berikatan dengan subunit 50 S ribosom. Kloramfenikol menghambat ikatan asam amino baru pada rantai peptida yang memanjang, karena kloramfenikol menghambat enzim peptidil transferase. Kloramfenikol bersifat bakteriostatik dan bakteri dapat tumbuh kembali jika pengaruh obat dihilangkan. Mikroorganisme resisten terhadap kloramfenikol menghasilkan enzim kloramfenikol asetiltransferase yang merusak aktivitas obat. Produksi enzim ini biasanya dibawah kontrol plasmid.

Tetrasiklin


Tetrasiklin merupakan sekelompok obat yang masing-masing berbeda secara fisik dan karakteristik farmakologi, tapi sebenarnya mempunyai sifat antimikroba yang sama dan memberi resistensi silang yang sempurna. Semua tetrasiklin diabsorpsi di usus dan didistribusikan secara luas pada jaringan tubuh, tapi hanya sedikit masuk ke cairan serebrospinal. Beberapa dapat juga diberikan secara intravena atau intramuskuler. Obat ini diekskresi lewat empedu dan tinja.

Tetrasiklin ditarik ke dalam sel oleh bakteri yang peka dan menghambat sintesis protein dengan menghasilkan ikatan-ikatan aminoasil-tRNA pada unit 30S ribosom bakteri. Bakteri yang resisten gagal untuk menarik obat. Resistensi ini dibawah kontrol plasmid yang dapat berpindah. Tetrasiklin bersifat bakteriostatik. Menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif yang peka dan merupakan obat pilihan untuk infeksi yang disebabkan oleh riketsia, klamidia, dan Mycoplasma pneumoniae.

Tetrasiklin tidak menghambat fungi. Mereka secara temporer menekan sebagian flora perut normal, tapi dapat saja menyebabkan superinfeksi, khususnya dengan pseudomonas yang resisten terhadap tetrasiklin, proteus, stafilokokus, dan ragi.

Tetrasiklin memiliki efek samping berupa berbagai gangguan gastrointestinal (mual, muntah, diare), ruam kulit, lesi selaput lendir, dan demam, khususnya jika pemberian diperpanjang dan dalam dosis tinggi. Pergantian flora bakteri biasanya terjadi. Pertumbuhan berlebihan dari ragi pada selaput lendir anal dan vaginal selama pemberian tetrasiklin menimbulkan inflamasi dan gatal-gatal. Pertumbuhan berlebihan organisme usus dapat menyebabkan enterokolitis.

Trimethoprim/Sulfametoksazol


Penemuan kombinasi antara trimethoprim dengan sulfonamid merupakan sebuah kemajuan penting dalam perkembangan penggunaan antimikroba yang efektif secara klinis dan merupakan aplikasi praktis dari sebuah teori yang menyatakan bahwa jika dua obat yang bekerja pada langkah yang berurutan dalam sebuah jalur reaksi enzimatik pada bakteri, hasilnya adalah sinergisme. Kombinasi antara trimethoprim dan sulfonamid, biasanya digunakan sulfametoksasol dengan perbandingan satu berbanding lima. Kombinasi ini biasa disebut kotrimoksasol. Selain digunakan secara kombinasi, sulfametoksasol dan trimethoprim masing- masing juga dapat menjadi preparat tunggal.

Spektrum antimikroba trimethoprim mirip dengan sulfametoksasol, walaupun trimethoprim 20-100 kali lebih kuat dari sulfametoksasol. Sebagian besar mikroorganisme gram negatif dan gram positif sensitif terhadap trimethoprim, tetapi resistensi dapat berkembang seiring dengan pemakaian tunggal obat ini. Pseudomonas aeruginosa , Bacteroides fragilis , dan enterococci biasanya resisten terhadap trimethoprim. Terdapat variasi yang berarti pada sensitivitas enterobacteriaceae terhadap trimethoprim pada letak geografis yang berbeda dikarenakan penyebaran resistensi yang dimediasi oleh plasmid dan transposon.

Corynebacterium diphtheriae dan N. meningitidis sensitif terhadap trimethoprim-sulfametoksasol. Meskipun sebagian besar S. pneumoniae masih sensitif, namun terdapat kecenderungan peningkatan resistensi. Sebanyak 50%- 95% strain Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, S. pyogens, Streptococcus viridans, E. coli, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Proteus rettgerii, Enterobacter sp ., Salmonella sp., Shigella sp., Pseudomonas pseudomallei, Serratia sp., dan Alcaligenes sp. terhambat oleh kombinasi ini. Klebsiella, Brucella abortus, Pasteurella haemolytica, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterolitica, dan Nocardia asteriodes juga sensitif pada kombinasi ini. Strain S. aureus yang resisten metisilin meskipun juga resisten terhadap trimethoprim dan sulfametoksasol preparat tunggal, mungkin dapat sensitif terhadap kombinasinya.

Mekanisme kerja kombinasi obat ini merupakan hasil dari aksi kedua obat tersebut pada dua langkah reaksi enzimatik yang menghasilkan asam tetrahidrofolat. Pada beberapa mikroorganisme, asam p -aminobenzoat (PABA) merupakan metabolit yang penting untuk sintesis asam folat. Sulfonamid memiliki struktur yang analog dengan PABA dan menghambat enzim dihidropteroat sintase.2 Proses tersebut akan mengganggu terbentuknya asam dihidrofolat yang nantinya akan direduksi oleh dihidrofolat reduktase untuk menjadi asam tetrahidrofolat.

Sulfonamid dapat masuk ke dalam reaksi yang melibatkan PABA dan bersaing pada sasaran enzim yang aktif. Sebagai hasilnya, dibentuk asam folat analog yang nonfungsional, sehingga bakteri tidak dapat tumbuh. Namun penghambatan oleh sulfonamid dapat berkurang jika terdapat penambahan PABA karena terjadi inhibisi kompetitif. Beberapa bakteri yang bersifat seperti sel hewan (tidak mensintesis asam folat) tidak peka terhadap sulfonamid.2

Trimethoprim menghambat enzim dihidrofolat reduktase 50.000 kali lebih kuat pada bakteri daripada sel mamalia. Enzim ini mereduksi dihidrofolat menjadi asam tetrahidrofolat yang merupakan rangkaian sintesis purin, dan juga DNA. Sulfonamid dan trimethoprim dapat digunakan secara sendiri untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Namun jika digunakan bersama, dihasilkan penghambatan ganda yang berurutan, dan berakibat peningkatan aktivitas yang nyata.

Resistensi pada trimethoprim dapat terjadi akibat menurunnya permeabilitas sel, produksi berlebih dari dihidrofolat reduktase, atau produksi reduktase yang telah berkurang kemampuannya untuk berikatan dengan obat. Resistensi dapat muncul akibat mutasi, walaupun lebih sering diakibatkan oleh plasmid yang mengkode dehidrofolat reduktase yang resisten trimethoprim.

2 Likes