© Dictio 2017 - 2019, Inc. All Rights Reserved. Terms of Use | About Us | Privacy Policy


Bagaimana cara melakukan pengukuran Laju Fiksasi Nitrogen?

Fiksasi nitrogen merupakan suatu proses reduksi dinitrogen (N2) menjadi amonia (NH3) yang dikatalis oleh enzim nitrogenase. Fiksasi nitrogen hanya dapat dilakukan oleh organisme prokariot, karena enzim nitrogenase hanya dikode pada genome prokariot (Fay 1992).

Pengukuran aktivitas enzim nitrogenase atau laju fiksasi nitrogen dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung. Pengukuran langsung diantaranya dengan mengukur peningkatan kandungan nitrogen total dalam suatu sistem menggunakan analisis Kjeldahl dan dengan mengukur perubahan komposisi dari isotop nitrogen (15N2 atau 13N2). Pengukuran laju fiksasi nitrogen secara tidak langsung adalah dengan metode acetylene reduction assay (ARA) (Hardy dkk. 1968).

Analisis Kjeldahl


Analisis kjeldahl merupakan salah satu teknik pengukuran laju fiksasi nitrogen yang pertama berkembang dan digunakan untuk menentukan kandungan total nitrogen dalam suatu sistem (Stewart 1980). Pinsip dasar dalam analisis kjeldahl adalah mengukur kandungan amonium dalam sampel dengan distilasi alkalin (Venkataraman 1981).

Metode kjeldahl mulai ditinggalkan karena beberapa alasan. Beberapa kelemahan analisis kjeldahl diantaranya memerlukan banyak waktu dalam proses analisis dan memerlukan sampel dalam jumlah besar untuk menghasilkan data yang baik (George & Delfino 1982).

Sebagai contoh, penelitian dengan 10 perlakuan membutuhkan 2.650 analisis kjeldahl untuk mendapatkan data yang akurat (Roger & Kulasooriya 1980).

Analisis isotop 15N2 dengan spektrofotometri


Analisis isotop 15N2 dengan spektrofotometri dahulu telah banyak dilakukan untuk pengukuran laju fiksai nitrogen in situ karena lebih sensitif dibandingkan pengukuran nitrogen dengan analisis Kjeldahl (Hellebust & Craigie 1978).

Pengujian dengan isotop 15N2 melibatkan 3 prosedur analisis, yaitu konversi isotop nitrogen dalam sampel menjadi amonium, konversi amonium menjadi nitrogen melalui oksidasi dengan penambahan alkaline sodium hypobromida, dan perhitungan komposisi isotop nitrogen dengan spektrometer (Venkataraman 1981).

Kerumitan proses analisis dan tingginya biaya menjadi salah satu kendala yang membatasi meluasnya penggunaan metode analisis isotop 15N2 dengan spektrofotometri (Hardy dkk. 1968).

Acetylene Reduction Assay (ARA)


Pengukuran dengan reduksi asetilen didasarkan pada kemampuan enzim nitrogenase untuk mereduksi beberapa komponen dengan ikatan rangkap 3 selain dinitrogen, yaitu asetilen (Reporter 1985). Gas etilen yang terbentuk sebagai hasil reduksi asetilen dapat dideteksi dengan kromatografi gas. Pembentukan gas etilen dari asetilen merupakan suatu proses yang bersifat spesifik, karena tidak ada sistem biologi lain yang melakukan reaksi tersebut (Postgate 1982).

Prinsip dari metode ARA adalah memisahkan gas etilen dengan kromatografi, kemudian mengukur konsentrasi gas etilen tersebut dengan ionisasi api hidrogen (Hellebust & Craigie 1978). Gas asetilen dan etilen dapat menembus membran sel heterokis, sehingga aktivitas enzim nitrogenase dapat diukur secara in vivo maupun in vitro dengan metode ARA (Halbleib & Ludden 2000).

Metode ARA dipilih karena telah banyak digunakan dalam penelitian-penelitian terdahulu serta merupakan prosedur pengujian yang relatif lebih mudah dan murah dibandingkan analisis dengan spektrofotometri (Marschener 1995).

Penelitian Hellebust & Craigie (1978) pada sampel Cyanobacteria membuktikan bahwa waktu inkubasi 30 menit secara umum cukup untuk pengujian dengan metode ARA. Sebagai contoh, spesies Anabaena dan Nostoc dapat menghasilkan 0,5–5 nmol C2H4 min-1 mg-1 protein atau 15–150 nmol C2H4 per botol uji dalam 30 menit. Penelitian Matsuguchi dkk . (1977) menyimpulkan bahwa waktu inkubasi yang lebih pendek menghasilkan data yang lebih baik, karena waktu inkubasi yang terlalu lama (lebih dari 3 jam) dapat memengaruhi pertumbuhan bakteri penambat nitrogen. Selain itu, etilen yang dihasilkan dapat terurai kembali jika inkubasi dilakukan terlalu lama.

Waktu inkubasi dihitung setelah penambahan 1 ml (10%) gas asetilen pada tabung reaksi 10 ml (tabung inkubasi) (Prosperi 2006). Penggunaan 10% asetilen untuk inkubasi telah banyak digunakan dalam penelitian ARA terdahulu, diantaranya penelitian Pereira dkk . (2009) pada Cyanobacteria dan Hardy dkk. (1968) pada bakteri Azotobacter dan Clostridium .

Secara teori, reduksi 3 mol asetilen menjadi etilen setara dengan transfer 1 mol nitrogen menjadi ammonia. Rasio 3:1 telah secara luas digunakan untuk mengartikan kecepatan reduksi asetilen dalam suatu area atau volume berdasarkan kecepatan fiksasi nitrogen (Reporter 1985; Seitzinger & Garber 1987). Faktor konversi sebesar 3 didasarkan pada fakta bahwa reaksi reduksi asetilen menjadi etilen membutuhkan 2 elektron, sedangkan reduksi nitrogen menjadi amonia membutuhkan 6 elektron (Jensen & Cox 1983).

Kromatografi Gas


Kromatografi adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan dan menganalisis komponen dalam suatu campuran. Berdasarkan jenis fase diam yang digunakan, kromatografi gas terbagi menjadi 2, yaitu kromatografi gas padat dan kromatografi gas cair (Mc Nair & Bonelli 1968). Prinsip kerja kromatografi gas didasarkan pada perbedaan daya tarik atau interaksi antara zat yang ada di dalam komponen dengan fase bergerak dan fase diam yang digunakan dalam sistem kromatografi (Mc Nair & Miller 1998).

Perbedaan interaksi tersebut menyebabkan perbedaan laju untuk masing- masing zat. Laju didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan bagi sejumlah materi untuk melewati jarak tertentu (Parker 1997). Masing-masing zat yang telah terpisah akan mencapai bagian akhir kolom kromatografi pada waktu yang berbeda. Waktu retensi ( retention time ) didefinisikan sebagai banyaknya waktu yang dibutuhkan oleh suatu komponen untuk melewati kolom. Waktu retensi untuk zat tertentu yang belum diketahui jenisnya diukur dengan cara membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram standar berupa zat yang telah diketahui (Wade 1997).

Zat yang telah terpisah akan menghasilkan sinyal-sinyal elektrik tertentu untuk kemudian ditangkap oleh detektor (Wade 1997). Laju dan konsentrasi masing-masing zat yang terekam oleh detektor akan dicetak dalam bentuk kromatogram. Kromatogram adalah rekaman tertulis yang diperoleh dari analisis kromatografi. Kromatogram menggambarkan suatu kurva hubungan antara waktu retensi dengan konsentrasi masing-masing zat yang telah terpisah (Mc Nair & Bonelli 1968).