Bagaimana cara melakukan Identifikasi Senyawa suatu kandungan tumbuhan?


(Kevin Raharjo) #1

Senyawa organik begitu penting untuk dilakukan pengidentifikasikan, dimana dapat mengetahui sifat-sifat dari suatu senyawa organik yang belom diketahui namanya atau sample larutan tidak tertera nama larutan atau senyawanya.

Bagaimana cara melakukan Identifikasi Senyawa suatu kandungan tumbuhan ?


(Tika Amalia) #2

Pada identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah kandungan itu diisolasi dan dimurnikan, pertama-tama harus kita tentukan dahulu golongannya, kemudian barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Sebelum itu, keserbasamaan senyawa tersebut harus diperiksa dengan cermat, artinya senyawa harus membentuk bercak tunggal dalam beberapa sistem KLT dan atau KKt.

Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan RF, dan ciri spektrum UV. Uji biokimia dapat bermanfaat juga : adanya glukosida dapat dipastikan dengan hidrolisis yang menggunakan β–glukosidase; adanya glukosida minyak amandel dengan hidrolisis yang menggunakan mirosinase, dan sebagainya. Untuk senyawa pengatur tumbuh, uji biologi merupakan bagian identifikasi yang penting.

Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung pada pengukuran sifat atau ciri lain, yang kemudian dibandingkan dengan data dalam pustaka. Sifat yang diukur termasuk titik leleh (untuk senyawa padat), titik didih (untuk cairan), putaran optik (untuk senyawa aktif optik), dan RFatau RRt (pada kondisi baku). Tetapi, data mengenai senyawa tumbuhan yang sama ialah ciri spektrumnya, termasuk pengukuran spektrum UV, inframerah (IM), resonansi magnet inti (RMI), dan spektrum massa (SM). Biasanya senyawa yang pernah diketahui dapat diidentifikasi berdasarkan data diatas. Untuk pemastian akhir harus dilakukan pembandingan langsung dengan senyawa autentik (bila ada).

Bila senyawa autentik tidak ada, pembandingan saksama dengan data pustaka sudah cukup untuk identifikasi. Bila menjumpai senyawa baru, semua data diatas sudah cukup untuk menentukan cirinya. Tetapi, untuk senyawa baru, pemastian identitas sebaiknya dengan penguraian kimia atau dengan mensintesis senyawa tersebut.

Identifikasi senyawa tumbuhan baru dengan kristalografi sinar-X sekarang sudah menjadi rutin dan dapat dilakukan bila senyawa itu cukup jumlahnya dan berbentuk kristal. Cara ini terutama sangat bermanfaat pada kasus terpenoid rumit karena dengan cara ini dalam sekali kerja saja kita dapat menentukan sekaligus struktur kimia dan stereokimia.

Sekarang akan dikemukakan ulasan singkat mengenai berbagai cara spektrofotometri itu dan perbandingan peranan masing-masing pada identifikasi fitokimia.

1. Spektroskopi UV dan spektrum tampak

Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dengan larutan yang sangat encer dengan pembanding blanko pelarut serta menggunakan spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa berwarna diukur pada jangka 200 sampai 700 nm. Panjang gelombang serapan maksimum dan minimum pada spektrum serapan yang diperoleh direkam (dalam nm), demikian juga kekuatan absorbansi (keterserapan) (atau kerapatan optik) pada maksimal dan minimal yang khas. Bahan yang diperlukan hanya sesepora saja karena sel spektrofotometri baku (1 x 1 cm) hanya dapat diisi 3 ml larutan.

Dengan menggunakan sel khusus hanya diperlukan sepersepuluh volume tersebut. Pengukuran spektrum yang demikian itu penting pada identifikasi kandungan tumbuhan, yaitu untuk memantau eluat dari kolom kromatografi sewaktu pemurnian dan untuk mendeteksi golongan senyawa tertentu, misalnya poliasetilena, pada waktu penjaringan ekstrak kasar tumbuhan.

Pelarut yang banyak digunakan untuk spektroskopi UV ialah etanol 95% karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut tersebut. Alkohol mutlak niaga harus dihindari karena mengandung benzena yang menyerap di daerah UV pendek. Pelarut lain yang sering digunakan ialah air, metanol, heksana, eter minyak bumi dan eter. Pelarut seperti kloroform dan piridina umumnya harus dihindari karena menyerap kuat di daerah 200 – 260 nm; tetapi sangat cocok untuk mengukur spektrum pigmen tumbuhan, seperti karotenoid, di daerah spektrum tampak.

Bila zat diisolasi sebagai senyawa berbentuk kristal dan bobot molekulnya diketahui atau dapat ditentukan, maka intensitas serapan pada panjang gelombang maksimal (λ maks) dinyatakan sebagai log ϵ, dengan ϵ=A/Cl (A=absorbansi, C=konsentrasi dalam g mol/l, l=panjang alur sel dalam cm, biasanya 1). Untuk senyawa yang baik konsentrasi maupun bobot molekulnya tidak diketahui, kita harus menggunakan bilangan absorbansi. Dalam hal demikian, tinggi berbagai maksima dapat dibandingkan dengan memperhatikan absorbansi sebagai persentase puncak yang paling kuat intensutasnya.

Pemurnian merupakan suatu keharusan sebelum kita melakukan telaah spektrum, dan kandungan tumbuhan yang menunjukkan ciri serapan yang khas harus diulangi pemurniannya sampai ciri khas tersebut tidak berubah lagi. Pada pemurnian dengan cara kromatografi kertas, untuk mengkompensasi cemaran yang berasal dari kertas saring dan menyerap di daerah UV, maka sebagai pelarut blanko pada pengukuran spektrum dapat digunakan eluat kertas saring blanko yang disiapkan bersamaan waktunya dengan penyiapan cuplikan. Prosedur yang serupa harus diikuti juga bila pemurnian dilakukan dengan plat KLT.

image
Gambar Spektrum serapan ultraviolet xanton, mangiferin. Kurva A : pelarut EtOH 95%. Panjang gelombang maksimum 240, 258, 316, dan 364 nm; panjang gelombang minimum
215, 248, 285, dan 338 nm. Intensitas serapan nisbi pada maksimum ialah, berturut-turut 82, 100, 50, dan 37%. Kurva B : Pelarut EtOH 95% + 2 tetes NaOH 2 N.

Kegunaan pengukuran spektrum untuk tujuan identifikasi dapat ditingkatkan dengan pengukuran berulang dalam larutan netral, pada jangka pH yang berbeda-beda atau dengan menambahkan garam anorganik tertentu. Misalnya, bila larutan senyawa fenol dalam alkohol ditambah alkali, secara khas spektrum bergeser ke arah panjang gelombang yang lebih besar (mengalami geser batokrom) dengan absorbansi yang meningkat. Sebaliknya, bila alkali ditambahkan ke dalam larutan netral asam karboksilat, geseran terjadi ke arah berlawanan, yaitu ke panjang gelombang yang lebih kecil (geser hipsokrom). Reaksi kimia, seperti reduksi (dengan natrium borohidrida) atau hidrolisis enzim, dapat diamati dengan baik dalam kuvet sel suatu spektrofotometer rekam. Pengukuran serapan yang dilakukan pada jangka waktu tertentu akan menunjukkan apakah nilai reduksi atau hidrolisis telah berlangsung.

Nilai spektrum UV dan spektrum tampak pada identifikasi kandungan yang tidak dikenal sudah jelas berkaitan dengan kerumitan nisbi spektrum dan letak umum panjang gelombang maksimal. Bila suatu senyawa menunjukkan pita serapan tunggal antara 250 dan 260 nm, senyawa itu mungkin salah satu dari sejumlah senyawa (misalnya fenol sederhana, suatu purina atau pirimidina, suatu asam amino aromatik dan seterusnya).

Tetapi, bila senyawa itu menunjukkan tiga puncak yang jelas di daerah 400 – 500 nm dengan sedikit serapan di daerah lain, sudah hampir dapat dipastikan senyawa tersebut karotenoid. Di samping itu, pengukuran spektrum dalam dua atau tiga pelarut lain, dan membandingkannya dengan data pustaka, dapat menunjukkan identitas karotenoid tersebut.

Pernyataan diatas menunjukkan bahwa spektrum serapan mempunyai nilai khusus pada telaah pigmen tumbuhan dan demikianlah halnya, baik untuk bahan pewarna tumbuhan yang larut dalam air maupun yang larut dalam lipid Golongan lain yang menunjukkan ciri serapan khasnya ialah senyawa tak jenuh (terutama golongan poliasetilena), senyawa aromatik umumnya (misalnya asam hidroksi sinamat), dan keton. Tidak adanya penyerapan UV juga memberi informasi yang bermanfaat mengenai struktur. Hal itu menunjukkan adanya lipid atau alkana dalam fraksi lipid ekstrak tumbuhan, atau petunjuk adanya sam organik, asam amino alifatik, atau gula dalam fraksi yang larut dalam air. Karena keterbatasan ruang, dalam buku ini hanya dapat diberikan ciri spektrum kandungan tumbuhan dalam jumlah yang terbatas. Ini terutama disajikan dalam bentuk tabel panjang gelombang maksimal, tetapi beberapa contoh spektrum juga diberikan.

2. Spektroskopi inframerah (IM)

Spektrum inframerah senyawa tumbuhan dapat diukur dengan spektrofotometri inframerah yang merekam secara otomatis dalam bentuk larutan (dalam kloroform, karbontetraklorida, 1-5 %), bentuk ge rusan dalam minyak nuyol, atau bentuk padat yang dicampur dengan kalium bromida. Pada cara terakhir, tablet atau cakram tipis dibuat dari serbuk yang mengandung kira-kira 1 mg bahan dan 10-100 mg kalium bromida dalam kondisi tanpa air, dibuat dengan menggunakan cetakan atau pengempa. Jangka pengukuran mulai dari 4000 sampai 667 cm -1 (atau 2,5 sampai 15 µm), dan perekaman spektrum memakan waktu kira-kira 3 menit. Contoh spektrum IM yang dibuat dengan cara tersebut terlihat pada gambar.

image
Gambar Spektrum inframerah dua alkaloid dari asap tembakau. Keterangan: (a) harmana, alam (I) dan sintetik (II) ; (b) norharmana, alam (I) dan sintetik (II). Perhatikan spektrum inframerah menurut tradisi direkam terbalik bila dibandingkan dengan spektrum UV dan spektrum tampak (gambar 1.4). Jadi, pita serapan disini mengarah kebawah.

Daerah pada spektrum inframerah diatas 1200 cm-1 menunjukkan pita spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus fungsi dalam molekul yang di telaah daerah dibawah 1200 cm -1 menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul, dan karena kerumitannya dikenal sebagai daerah ‘sidik jari’. Intensitas berbagai pita direkam secara subjektif pada skala sederhana : kuat (K), menengah (M), atau lemah (L).

Kenyataan yang menunjukkan bahwa banyak gugus fungsi dapat diidentifikasi dengan menggunakan frekuensi getaran khasnya mengakibatkan spektrofotometri inframerah merupakan cara paling sederhana dan sering paling terandalkan dalam menentukan golongan senyawa. Walau pun demikian, dalam fitokimia, sprektroskopi IM paling sering digunakan sebagai alat ‘pembuat sidik jari’ untuk membandngkan cuplikan alam dengan cuplikan sintesis. Kerumitan spektrum IM memang sangat cocok untuk tujuan tersebut, dan perbandingan yang demikian itu sanagat penting pada identifikasi lengkap berbagai jenis kandungan tumbuhan. Misalnya, spektrum IM telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi komponen minyak atsiri yang sudah dikenal ketika senyawa itu dipisahkan dengan KGC pada skala preparatif.

Dua spektrum komponen asam tembakau diidentifikasi sebagai basa harmana dan nonharmana dengan menggunakan cairan tablet KBr. Perlu dicatat bahwa beberapa bagian terinci di daerah sidik jari kedua alkaloid pada cuplikan alam tidak ada, mungkin disebabkan oleh adanya sesepora cemaran. Dapat juga dilihat bahwa walau pun struktur kedua alkaloid itu sangat serupa (perbedaannya hanya pada CH3, yaitu harmana merupakan turunan C- metil nonharmana), keduanya apat segera dibedakan dengan menggunakan spektrum IM- nya.

3. Spektroskopi Massa (SM)

SM, sejak penampilannya yang nisbi baru (kira-kira 1960), telah merevolusikan penelitian biokimia mengenai bahan alam dan telah meringankan fitikimiawan dalam banyak hal. Nilai cara ini terletak pada kecilnya jumlah bahan yang diperlukan (skala mikrogram), kemampuannya menentukan bobot molekul dengan tepat, kemampuannya menghasilkan pola fragmentasi rumit yang sering khas bagi senyawa yang bersangkutan sehingga dapat diidentifikasi.

Pada dasarnya SM adalah penguraian sesepora senyawa organik dan perekaman pola fragentasi menurut massanya. Uap cuplikan berdifusi ke dalam sistem sprektrometer massa yang bertekanan rendah, lalu diionkan dengan energi yang cukup untuk memutus ikatan kimia. Ion bermuatan positif yang terbentuk dipercepat dalam medan magnet yang menyebarkan ion tersebut dan memungkinkan pengukuran kelimpahan nisbi ion yang mempuyai nisbah massa terhadap muatan tertentu. Rekaman kelimpahan ion terhadap massa merupakan grafik spektrum massa yang terdiri atas sederetan garis yang intensitasnya berbeda-beda pada satuan massa yang berlainan.

Pada kebanyakan senyawa, sebagian kecil dari senyawa induk tahan terhadap proses penguapan dan akan direkam sebagai puncak ion molekul atau ion induk. Lalu, massa ion induk dan ion lainnya dapat diukur dengan sangat tepat. Ketepatannya sedemikian rupa sehingga dapat menunjukkan rumus molekul senyawa secara tepat dan dengan demikian analisis unsur yang lazim (yang biasanya memerlukan beberapa mg senyawa) tidak diperlukan lagi.

Beberapa dengan spektrofotometer UV dan IM, yang biasanya dijalankan oleh fitokimiawan sendiri, alat untk menentukan spektrum massa dan RMI lebih mahal dan jauh lebih canggih sehingga biasanya dijalankan oleh tenaga terlatih. Karena itu, fitokimiawan menyerahkan cuplikannya untuk dianalisis dan menerima kembali hasilnya dalam bentuk grafik yang terlihat pada gambar 1.6. Spektrometri massa berhasil baik hampir untuk semua jenis kandungan tumbuhan yang berbobot molekul rendah, bahkan alat tersebut telah digunakan untuk menganalisis peptida. Dalam alat SM, senyawa yang terlalu sukar diuapkan diubah menjadi eter trimetilsilil, SM seringkali digabung dengan KGC sehingga dengan sekali kerja kita memperoleh hasil identifikasi kualitatif dan kuantitatif dari sejumlah komponen yang strukturnya rumit, yang mungkin terdapat bersaam-sama dalam ekstrak tumbuhan.

Perkembangan cara baru senantiasa muncul pada spektroskopi massa, dan spektrometer modern dapat dilengkapi dengan sumber pemboman atom cepat (BAC). Dengan demikian ia mampu menganalisis senyawa yang mudah terurai atau senyawa takatsiri, termasuk garam dan bahan berbobot molekul tinggi. Dulu, bila kita menggunakan SM pada analisis glikosida tumbuhan, gula O-glikosida hilang dalam proses sehigga tidak terdeteksi. Tetapi sekarang, mungkin saja kita memperoleh ion molekul senyawa glikosida induk dengan SM-BAC.

image
Gambar Spektrum massa senyawa pengatur zeatin

4. Spektroskopi resonansi magnet inti (RMI)

Spektroskopi RMI proton pada hakikatnya merupakan sarana untuk menentukan struktur senyawa otrganik dengan mengukur momen magnet atom hidrogennya. Pada kebanyakan senyawa, atom hidrogen terikat pada gugus yang berlainan (seperti –CH2-, -CH3, -CHO, -NH2, -CHOH-, dan sebagainya) dan spektrum RMI proton merupakan rekaman sejumlah atom hidrogen yang berada dalam keadaan lingkungan yang berlainan tersebut. Tetapi, spektrum itu tidak dapat memberikan keterangan langsung mengenai sifat kerangka karbon molekul tersebut ; ini hanya dapat diperoleh dengan sprektroskopi RMI karbon-13 yang akan diterangkan kemudian.

Dalam praktek, larutan cuplikan dalam pelarut lembam ditempatkan di antara kutub magnet yang kuat, dan proton mengalami geser kimia yang berlainan sesuai dengan lingkungan molekulnya di dalam molekul. Ini diukur dalam radas RMI, nisbi terhadap baku, biasanya tertametilsilan (TMS), yaitu senyawa lembam yang dapat ditambahkan ke dalam larutan cuplikan tanpa ada kemungkinan terjadinya reaksi kimia.

Geser kimia diukur dengan satuan δ (delta) atau τ (tau); dengan τ=-10δ dan δ=Δv x 106/frekuensi radio, Δv adalah seliih antara frekuensi penyerapan cuplikan dan frekuensi penyerapan senyawa pembanding TMS dalam satuan Hertz. Karena frekuensi radio total biasanya 60 Mega Hertz (60 juta Hertz) dan ger=seran diukur dalam satuan Hertz, maka satuan ini sering disebut bagian per juta, bpj (ppm). Juga intensitas sinyal dapat diintegrasi untuk menunjukkan jumlah proton yang beresonansi pada frekuensi tertentu.

Pelarut untuk pengukuran RMI harus lembam dan tanpa proton. Karena itu kita hanya menggunakan karbontetraklorida, deuterokloroform (CDCl3), deuterium oksida (D2O), deuteroaseton (CD3COCD3), atau dimetilsulfoksida terdeuterasi. Senyawa polar seringkali hanya larut sedikit atau tidak larut dalam pelarut yang ada, dan untuk pengukuran harus diubah dulu menjadi eter trimetilsilil. Paling sedikit diperlukan 5-10 mg cuplikan, dan ini membatasi penggunaan spektroskopi RMI dalam banyak percobaan fitokimia. Tetapi, spektrometer yang hanya memerlukan cuplikan 1 mg akan tersedia dalam waktu dekat. Satu kelebihan spektroskopi RMI bila dibandingkan dengan SM ialah cuplikan dapat diperoleh kembali, tidak berubah setelah pengukuran, dan dapat digunakan lagi untuk pengukuran lain.

Sama halnya dengan cara spektroskopi lain, spektroskopi RMI proton dapat digunakan oleh fitokimiawan sebagai alat sidik jari. Tetapi harus diingat, kerumitan spektrum berkaitan langsung dengan jumlah jenis proton yang berbeda yang ada sehingga sesungguhnya alkaloid rumit yang banyak tersubstitusi akan menghasilkan sinyal lebih sedikit ketimbang hidrokarbon alifatik sederhana. Penggunaan utama RMI proton ialah untuk menentukan struktur dengan cara digabung dengan cara spektroskopi lainnya.

Penggunaannya dalam menentukan golongan senyawa sangat banyak ; beberapa contoh geser kimia yang khas bagi golongan senyawa alam tertentu terdapat Dalam tabel dibawah, Proton aromatik (pada turunan benzena atau senyawa heterosiklik)jelas berbeda dari proton alifatik. Demikian juga dalam suatu golongan senyawa pengukuran RMI sering kali memberikan jalan untuk mengidentifikasi struktur senyawa tersebut.

image
Tabel Ciri geser kimia resonansi megnet inti proton berbagai golongan senyawa tumbuhan

5. Kriteria untuk identifikasi fitokimia

Seperti telah disebutkan diatas, suatu senyawa yang telah dikenal dan diketemukan lagi di dalam tumbuhan baru, dapat diindentifikasi berdasarkan perbandingan kromatografi dan spektrum dengan senyawa asli. Cuplikan asli dpaat diperoleh dari perusahaan niaga kimia, dengan cara isolasi ulang dari sumber yang telah diketahui, atau, sebagai usaha terakhir, dengan meminta kepada peneliti yang pertama kali mengisolasi dan memaparkannya. Sampai seberapa jauh kita harus melakukan pembandingan bergantung pada golongan senyawa yang ditelaah. Tetapi, sebagai pedoman umum, dapat dikatakan kita harus menggunakan sebanyak mungkin kriteria untuk meyakinkan kebenaran identifikasi.

Pembanding kromatografi harus didasarkan kepada ko-kromatografi senyawa dengan senyawa asli, tanpa pemisahan, paling sedikit dalam empat sistem. Bila KLT merupakan dasar utama pembandingan, jelas ada keuntungannya bila digunakan penjerap yang berlainan (misalnya selulosa dan silika gel disamping pengembangan yang berlainan pada satu jenis penjerap. bila mungkin, kita harus membandingkan senyawa tak dikenal itu dengan senyawa pembanding dengan menggunakan tiga kriteria kromatografi yang jelas. Kriteria itu misalnya waktu retensi pada KGC, KCKT dan RF pada KLT; atau RF pada KKt, KLT dan pergerakan nisbipada elektroforesis, demikian juga untuk pembanding spektrum harus digunakan dua cara atau lebih. Idealnya, semua spektrum UV, IM, dan RMI- 1H harus dibandingkan.

Pada senyawa tumbuhan baru biasanya kita dapat saja menentukan strukturnya berdasarkan pengukuran spektrum dan kromatografi, terutama yang bertalian dengan spektrum dan kromatografi senyawa yang sudah dikenal dalam deret yang sama. Penetapan struktur dapat dilakukan dengan pengubahan kimia dan menjadikannya senyawa yang sudah dikenal.

image
Tabel Jenis kriteria yang diperlukan untuk mengidentifikasi kandungan kimia tumbuhan yang telah dikenal. Identifikasi eter 7-metil 6-hidroksiluteolin dalam daun Crocus minimus

Pada waktu lampau, tahap penting dalam identifikasi struktur ialah menentukan rumus molekul dengan cara mikro analisis sekurang-kurangnya dengan menentukan karbon hidrogen. Mikroanalisis yang demikian masih tetap diperlukan, tetapi bila kita hanya mempunyai beberapa mikrogram senyawa, sekarang dapat saja kita mengukur massa ion molekul dengan tepat, yaitu dengan spektrometer. pada senyawa baru, membuat turunannya bermanfat pula, misalnya membuat asetat, eter metil, dan sebagainya, karena analisis senyawa turunannya itu akan menambah yakinan mengenai rumus molekul senyawa asalnya.

Sumber :
Lully Hanni Endarini, Farmakognisi dan Fitokimia, Badan Pengembangan dan Pemberdayaan Sumber Daya Manusia Kesehatan